最新2021 CLSI M100 要点更新细数

受到新冠疫情的影响，今年的CLSIM100更新姗姗来迟。而今年又有哪些重要更新，接下来让我们一起来了解一下。

01

全彩正文，关键信息更明确

翻开CLSI正文，第一感觉就是所有表格变成了全彩，凸显了关键信息。

如所有表头、标题、各种分格等全部变成了彩色，关键信息更加突出。

02

血培养报阳后直接纸片扩散法检测

虽然2019年EUCAST推出了血培养报阳快速药敏检测——RAST实验，但是EUCAST药敏体系本身和CLSI存在一定差异，如结果解释、折点包括纸片含量等均与CLSI不同，妨碍了此方法的推广和使用。今年CLSI就此增加了相关内容，为加速血培养报告，缩短药敏报告TAT，提供了一个相对可靠、标准的方法。

目前此方法仅适用于肠杆菌目细菌，适用药物也只有氨苄西林、氨曲南、头孢他啶、头孢曲松、妥布霉素和复方磺胺6种，和EUCASTRAST比较，测试的菌株种类和药物数量都比较少，同时缺少治疗血流感染非常关键的碳青霉烯类药物。

具体的操作流程如下

1

对于革兰染色为阴性的血培养瓶，取报阳8小时以内的血瓶，上下颠倒5-10次充分混匀；将血培养瓶盖消毒，并插上20G（国内标准为7#）排气针，向MH琼脂滴加4滴血培养报阳后肉汤，涂布均匀（参考KB法MH琼脂的涂布方式）；同时需要接种血平板进行纯培养，确认其纯度。

2

涂布完成后将其半开盖3-5分钟（不要超过15分钟），贴上抗生素的纸片。

3

在15分钟内放孵育箱倒置进行孵育。

CLSI建议16-18小时后，按照CLSIM02的要求量取抑菌圈直径，并使用M100中的表格2A中的折点进行解释报告，CLSI目前尚未完成对于短时间（如8-10小时）读取抑菌圈准确性和折点的评估。

检测结果

如果生长出现异常（如，混合接种、非融合生长、生长微弱导至无法读取），不要解读直接纸片扩散法的抑菌圈直径和结果解释，而需要直接报告纯培养后执行的标准药敏的操作。

如果发现双重抑菌环，或抑菌圈内存在菌落，首先需要检查纯度平板，确认纯度。

如果为纯培养则读取内圈。

质控方面和EUCAST不同，对于直接纸片扩散法测试，CLSI没有提出一套完整的质控流程，仍然沿用现有的质控方法。CLSI建议使用大肠埃希菌ATCC25922按照M02的要求进行质控。后续会有更为详细的CLSI血培养阳性快速药敏的方法细节解读，并就CLSI和EUCAST2种快速药敏方法的差异进行对比，供大家参考。

虽然从目前来看CLSI对于血培养阳性快速药敏还存在诸如使用范围较窄、药物种类偏少、不支持快速药敏读取等问题，但是至少规范了血培养报阳以后如何进行KB法药敏测试的操作方法。随着评估工作的进一步深入和发展，此方法的适用范围、快速结果判断等内容也会陆续更新。

而在实际工作中，VITEK2的药敏检测在8-12小时内。如果实验室可以合理规划药敏检测的时间，结合中国卡覆盖药物的优势，同样可以向临床提供快速药敏服务。

03

折点相关更新

a)葡萄球菌苯唑西林

自从2016年以来，几乎每年都会对葡萄球菌耐甲氧西林（苯唑西林）的折点进行更新（见下表所列），今年也不例外:

如下图总结，今年金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌属的苯唑西林MIC折点进行了更新，向上增加了1个对倍稀释度，敏感折点从0.25μg/mL上调至0.5μg/mL。并且对而后的注释进行了相应的调整。但是头孢西丁纸片法的折点没有变更。

目前CLSI中对于葡萄球菌耐甲氧西林的检测非常复杂，目前有5种表型检测方法：头孢西丁MIC法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林MIC法、苯唑西林纸片扩散法以及苯唑西林盐琼脂法。同时不同的葡萄球菌所使用的表型检测方法也有很大的差异，见下表：

这样造成了表格非常臃肿，就葡萄球菌而言，仅苯唑西林的折点表格就有3页。为此新版CLSI重新总结了葡萄球菌耐甲氧西林的检测表格，将1张大表分为2张小表，表格3G-1针对金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌，可用头孢西丁MIC法和头孢西丁纸片扩散法；苯唑西林【上海九院供卵试管】MIC法和苯唑西林盐琼脂法4种表型测试方法；表格3G-2针对金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌，可用头孢西林纸片法，苯唑西林纸片法和MIC法来进行检测。

目前VITEK2对于葡萄球菌的耐甲氧西林的检测，使用头孢西丁筛选实验（等效于头孢西丁纸片扩散法）和苯唑西林MIC相结合的方法；而对于金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌以外的葡萄球菌是否需要调整苯唑西林MIC折点，还有待进一步的研究。

b)阿奇霉素对于志贺菌折点，以及对于淋病奈瑟菌的纸片法折点

目前肠沙门伤寒血清型和志贺菌对于阿奇霉素有了相关折点，但CLSI也增加了相关的注释，对于志贺菌，特别是宋内氏志贺菌纸片法抑菌圈可能会模糊，难以测量。如抑菌圈难以测量，建议使用MIC法。

对于淋病奈瑟，增加了阿奇霉素的纸片法折点。

c)Lefamulin和亚胺培南-瑞莱巴坦的折点

Lefamulin是2019年FDA批准的半合成截短侧耳素类抗生素，通过通过与细菌核糖体的胎基转移酶中心相结合，从而抑制细菌生长所需蛋白质的合成途径发挥抗菌作用。主要用于治疗社区获得性肺炎，抗菌谱包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌（甲氧西林耐药菌株）、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体和衣原体等。目前CLSI新增了Lefamulin针对葡萄球菌；肺炎链球菌和嗜血杆菌的折点。此外截短侧耳素类是一个具有全新抗菌机制的新抗生素大类，其化学结构和现有抗菌【上海集爱可以供卵试管吗?】药物有很大差异，可以对β-内酰胺类，大环内酯类、喹诺酮类、四环素类药物耐药株同样具有抗菌活性。目前针对这些细菌仅有敏感折点，没有中介和耐药折点。

而亚胺培南-瑞莱巴坦是针对CRE的新药，瑞莱巴坦是一种新的β内酰胺酶抑制剂，与阿维巴坦较为类似，可以抑制丝氨酸酶，但是对于金属酶没有活性。目前也在国内进行相关的临床实验，有望在几年内推出。

今年CLSI增加了亚胺培南-瑞莱巴坦对于肠杆菌目、铜绿假单胞菌和厌氧菌的折点，并且在备注中强调，亚胺培南敏感可以推导亚胺培南-瑞莱巴坦敏感，但是亚胺培南-瑞莱巴坦敏感不能推导亚胺培南敏感。

d)其他折点相关更新

流感嗜血杆菌增加了头孢洛扎-他唑巴坦的敏感折点（仅MIC法≤0.5/4为敏感）。

04

I^的更新

在2020年的CLSI在肠杆菌目和铜绿假单胞菌折点中，对于部分药物的中介结果后增加了一个^符号，代表该药物在某些解剖部位存在潜在浓集。而在今年说的更加明确，这个部位就是尿路。

对于肠杆菌目的碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多尼培南的中介折点后增加了^符号。

05

QC方面和新增抗菌药物

对于QC表格，一般情况下大家比较关注现有药物QC范围的更新，毕竟这个直接与我们的日常工作直接相关，但是小编认为关注这个表格中的新增药物也非常重要，对于新【广东可以供卵的医院】抗菌药物上市，完善其药敏检测方法，确认质控范围是很重要的一步，因此通过这个表格了解一些即将上市的新抗菌药物。

a)头孢吡普（Ceftobiprole）纸片法的更新。

头孢吡普是和头孢罗膦类似的，具有抗MRSA活性的头孢菌素类药物，2008年在加拿大上市，但是目前尚未在美国和中国上市，目前CLSI对此药物没有相关折点，但是有MIC的操作方法和QC范围的建议。对于纸片扩散法，原来CLSI使用30μg的纸片，但是今年调整为使用5μg的纸片，与Eucast保持一致，同时调整质控菌株，使用大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。

b)增加Aztreonam-nacubactam和Cefepime-nacubactam的QC和MIC制备方法。

Nacubactam是一种新型的酶抑制剂，主要用于抑制肠杆菌目的丝氨酸酶（A类，C类和部分D类），同时也可以作用于青霉素结合蛋白（PBP2），具备双重耐药机制。可以和头孢菌素以及碳青霉烯类药物进行联用，目前尚处于临床实验中。目前CLSI中与nacubactam进行配伍的药物共有3个，分别为美罗培南、氨曲南和头孢吡肟，随着这些药物的陆续上市，可能会增加折点等方面的更新。

c)阿米卡星铜绿假单胞菌纸片扩散法QC范围的更新

阿米卡星铜绿假单胞菌纸片扩散法QC范围从20-26调整到18-26。

06

其他相关更新

a)折点更新列表

按照惯例，CLSIM100文件会列出2010年以后折点进行的列表，在今年把这个表格分为2列，将MIC法折点更新和纸片扩散法折点更新进行分列，如下表：

可以更加明确的梳理折点变更的历史。【公立医院供卵真的很难等吗】

b)CARBA方面的更新

2019年CLSIM100增加了附录H用于解释分子生物学检测耐药机制（MRS，VRE，CARBA，ESBL），今年对于CARBA的检测方面增加了一页表格，专门用于解释当3、4代头孢菌素敏感，但是碳青霉烯中介或耐药这种表型时，如何进行解释和报告。当产生这种表型，且CARBA阳性时，建议使用参考方法对药敏结果进行复核。如果复核后仍然存在耐药表型和CARBA结果不一致的情况，应该报告相矛盾的表型和基因型结果，并给出相关的注释“目前的临床和实验室数据不足以得出结论这些这些药敏结果为S或SDD的头孢菌素对这些产碳青霉烯酶的菌株有效”。

此外对于CARBA的检测靶标也发生了变更，除了KPC,OXA-48-like,VIM,NDM,orIMP5个CARBA位点以外，2021年CLSI也推荐使用mCIM和CarbaNP等碳青霉烯酶的表型实验作为靶标。

c)金黄色葡萄球菌复合群

随着质谱技术，以及分子生物学方法的应用，对于细菌分类的认识也在逐步深入中，在葡萄球菌的药敏表格中也增加了相关内容：

“S.aureuscomplexconsistsofthecoagulase-positivespeciesS.aureus,Staphylococcusargenteus,andStaphylococcusschweitzeri.IfS.argenteusisidentifiedbyMALDI-TOFMSorsequencing,itisrecommendedthatitbereportedas“S.aureuscomplex(S.argenteus),”andS.aureusphenotypictestingmethodrecommendations,breakpoints,andinterpretivecategoriesshouldbeused.HumaninfectionswithS.schweitzerihaveyettobereported.3”

银白色葡萄球菌（Staphylococcusargenteus）和Staphylococcusschweitzeri以往被认为是金黄色葡萄球菌的2个变种，2015重新命名，从金黄色葡萄球菌中区分出来[1]。目前的研究也表明这2种葡萄球菌也存在细胞毒素[2]，文献表明银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌有类似的致病性，并且同样具备SCCmec耐药基因。如果质谱鉴定结果为银色葡萄球菌，CLSI建议报告为金黄色葡萄球菌复合群（银白色葡萄球菌），使用金黄色葡萄球菌推荐的表型检测方法，折点和结果解释标准。而S.schweitzeri目前没有造成人类感染的报道。

两者最明显的差异在于银白色葡萄球菌因缺少操纵子crtOPQMN无法合成黄色色素呈现白色，但是金黄色葡萄球菌也有约10%的分离株是白色，正是这一类菌株的存在增加了区分两者的难度。可以通过MLST或其他分子生物学的方法区分银白色葡萄球菌，目前在国内已经银白色葡萄球菌的分离报告[3]。

d)特地唑胺

此外在葡萄球菌、肠球菌和链球菌的表格中增加了一条特地唑胺的注释，即“利奈唑胺敏感可以推导特地唑胺敏感，但是某些菌株即便对利奈唑胺耐药，也有可能对特地唑胺敏感”。但是目前特地唑胺尚未在国内上市，这条注释和我们关系不大。

e)黏菌素硫酸盐（Colistinsulfate）

在多黏菌素相关表格中，强调药敏实验需要使用的药物为黏菌素硫酸盐（Colistinsulfate），这个与黏菌素的药敏测试规则相关，黏菌素治疗可以甲磺酸盐，但是药敏实验只能使用硫酸盐。

参考文献

1.TongSYC,SchaumburgF,EllingtonMJ,etal.NovelstaphylococcalspeciesthatformpartofaStaphylococcusaureus-relatedcomplex:thenon-pigmentedStaphylococcusargenteussp.nov.andthenon-humanprimate-associatedStaphylococcusschweitzerisp.nov[J].Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2015,65(Pt1):15.

2.JohanssonC,RautelinH,KadenR.StaphylococcusargenteusandStaphylococcusschweitzeriarecytotoxictohumancellsinvitroduetohighexpressionofalpha-hemolysinHla[J].Virulence,2019,10(1):502-510.

3.ZhangDF,XuX,SongQ,etal.IdentificationofStaphylococcusargenteusinEasternChinabasedonanonribosomalpeptidesynthetase(NRPS)gene[J].Futuremicrobiology,2016,11(9):1113-1121.

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